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本制品是一款专为小鼠基因型快速鉴定设计的试剂盒，包含DNA粗提取及PCR扩增体系。本制品可直接利用小鼠尾巴、耳朵、脚趾等组织经Lysis Buffer、Proteinase K简单裂解处理后进行PCR扩增，无需过夜消化、酚氯仿抽提或柱式纯化等操作，使用简便，极大缩短实验耗时。产品适用于2kb以内目的片段的扩增以及3对引物以内的多重PCR反应。

本制品所提供的2×Mouse Tissue Direct PCR Mix中，包含经过基因工程改造的DNA聚合酶、Mg²⁺、dNTPs及优化的缓冲体系，具有极高的扩增效率和抑制物耐受度，使用时只需加入模板和引物，并补水至1×即可进行PCR反应，使用本制品扩增的PCR产物3’端带有一个突出的"A"碱基，纯化后可直接用于TA克隆。

• 操作简便：无需提取基因组DNA。
  
• 适用广泛：适用于多种小鼠组织的直接扩增。

• 为了避免样品间出现交叉污染，需准备多个取样工具，如需反复使用可在每次取样后用2%次氯酸钠溶液或实验环境核酸清洁剂对工具表面进行清洁。
  
• 建议使用新鲜采取的小鼠组织，取样量不宜过大，以避免影响扩增结果。
  
• Lysis Buffer的保存条件为2～8℃，若低温保存可能会出现沉淀，在使用前务必充分溶解。
  
• PCR Mix应避免反复冻融，短期内多次使用可置于4℃保存。

• 基因组DNA的释放
  
  • 裂解液配制
    根据需要裂解的小鼠样品数量配制组织裂解液（组织裂解液应现用现配，且充分混匀后使用），单个样品所需试剂比例如下：
    

    成分	用量
    Proteinase K	4μL
    Lysis Buffer	200μL

    
    
  • 样品准备与裂解
    推荐组织使用量：
    

    组织类型	小鼠尾尖	小鼠耳朵	小鼠脚趾
    推荐用量	1～3mm	2～5mm2	1～2个

    
    取适量小鼠组织样品于干净的离心管中，向每个离心管中加入200μL新鲜的组织裂解液，涡旋震荡后在55℃下孵育30min，然后98℃加热处理3min。
    
  • 离心
    将裂解产物充分震荡混匀，12000rpm离心5min，上清液可作为模板直接用于PCR扩增。模板如需保存，可将上清液转移至另一个无菌离心管中，并置于-20℃保存，保存时间为2周。
• 配制PCR扩增反应体系
  将2×Mouse Tissue Direct PCR Mix从-20℃取出后置于冰上解冻，上下颠倒混匀后按下表配制PCR反应体系（冰上操作）
  

  组分	25μL体系	50μL体系	终浓度
  2×Mouse Tissue Direct PCR Mix	12.5μL	25μL	1×
  引物1 (10μM)	1.0μL	2.0μL	0.4μM
  引物2 (10μM)	1.0μL	2.0μL	0.4μM
  裂解产物	根据需要加入，不应超过体系的1/10，过量可能会抑制PCR扩增。
  ddH2O	至25μL	至50μL

• 建议的PCR条件
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	94℃	5min	1
  变性	94℃	30s	35～40
  退火	Tm＋3～5℃	30s
  延伸	72℃	30s/kb
  终延伸	72℃	5min	1
  -	4℃	Hold	-

  退火温度：参考引物Tm值，建议退火温度设置为引物中Tm较小值加3～5℃。

• 无目的条带？
  
  • 裂解产物过量：选择最合适的模板用量，一般不超过体系的1/10。
    
  • 取样量过大：将裂解产物稀释10倍后扩增，或减少取样量重新裂解。
    
  • 组织样品不新鲜：建议使用新鲜的组织样品。
    
  • 引物质量差：使用基因组DNA进行扩增验证引物质量，优化引物设计。
• 出现非特异扩增？
  
  • 退火温度过低、循环数过高：提高退火温度，减少循环数。
    
  • 模板浓度太高：减少模板用量或将模板稀释10倍后扩增。
    
  • 引物特异性差：优化引物设计。